ไลโซไซม์ (lysozyme) หน้าที่ และประโยชน์ไลโซไซม์

423

ไลโซไซม์ (lysozyme)หรือ มูรามิเดส (Muramidaes) หรือเอ็นอะซีติลมูราไมค์ ไกลโคโนไฮโดรเลส (N-acetylmuramideglyconohydrolase, EC3.2.1.17) เป็นเอนไซม์ที่สามารถตรวจพบได้ทั้งในมนุษย์ สัตว์ พืช และแบคทีเรีย เช่น ในซีรัม น้ำตา น้ำลาย น้ำนม ยางมะละกอ ไข่ขาวของสัตว์ปีก แวคคิวโอล (Vauole) ของเซลล์พืช ไลโซไซม์ต้านเชื้อจุลชีพด้วยการทำลายผนังเซลล์ของแบคทีเรีย ในปีค.ศ. 1922 Alexander Fleming นักแบคทีเรียวิทยาชาวอังกฤษเป็นคนแรกที่ค้นพบคุณสมบัติการทำลายเชื้อแบคทีเรียของไลโซไซม์จากสารคัดหลังจากจมูก และน้ำตาของมนุษย์ และตั้งชื่อว่า “ไลโซไซม์” เนื่องจากเป็นเอ็นไซม์ที่ทำลายแบคทีเรีย (Enzyme + lysis)

advertisement

ชนิดไลโซไซม์
ไลโซไซดม์สามารถจำแนกได้ 3 ชนิดใหญ่ ๆ ตามลำดับของการเรียงตัวของกรดอะมิโน (amino acid sequence) และโครงสร้างตติยภูมิ (tertiary structure) ดังนี้
1. chicken – type lysozyme (C – type)
2. Goose – type lysozyme(G – type)
3. Phage lysozyme(T4 – type)

ไลโซไซม์มนุษย์จัดอยู่ในกลุ่ม C – type เนื่องจากโครงสร้างปฐมภูมิ (Primary structure) และโครงสร้างตติยภูมิของไลโซไซม์ที่พบในมนุษย์คล้ายคลึงกับไลโซไซม์ที่พบในไก่มาก

แหล่งกำเนิดไลโซไซม์ในน้ำลาย
ไลโซไซม์มนุษย์ถูกสังเคราะห์ขึ้นในเซลล์คัดหลัง (secretory cell) ของต่อมขับออกภายนอก (exocrine gland) หลายชนิด แล้วถูกขับออกมาในของเหลวชนิดต่างๆ ของร่างกาย ได้แก่ ซีรัม น้ำลาย น้ำตา น้ำมูก น้ำนม และของเหลวของร่างกาย (body fluid) อื่นๆ อีกหลายชนิด นอกจากนี้ยังสามารถพบไลโซไซม์ได้ในเนื้อเยื่อหลายชนิดของมนุษย์ และในเซลล์ไลน์ (cell line) ของมัยอีโลโมโนซัยทิค ลินิเอจ (myelomonocytic lineage) ไลโซไซม์จัดเป็นองค์ประกอบหนึ่งของกลไกการต้านเชื้อจุลชีพที่เกี่ยวข้องกับระบบโมโนซัยท์และแมคโครฟาจ (monocyte – macrophage system)

ไลโซไซม์ในน้ำลายมีแหล่งกำเนิดมาจากสองแหล่ง ได้แก่
1. แหล่งที่มาจากเซลล์ท่ออินเตอร์คาเลท (intercalated duct cell) ของต่อมน้ำลายหลัก
2. แหล่งที่มาจากพลาสมาโดยผ่านทางน้ำเหลืองเหงือก (gingival crevicular fluid)

ปริมาณไลโซไซม์ที่พบในน้ำลาย (Vhole saliva) ของมนุษย์อยู่ระหว่าง 2 – 80 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร (microgram / milliliter, μg/ml)

โครงสร้างเซลล์ไลโซไซม์
ไลโซไซม์เป็นโปรตีนทรงกลม (globular protein) ที่มีกรดอะมิโนเป็นส่วนประกอบ 129 ตัว มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 15 กิโลดอลตัน (kDa) เป็นโปรตีนที่มีประจุบวก (cationic protein) มีกรดอะมิโนซิสเตอีน (cysteine) เป็นส่วนประกอบ 8 โมเลกุล เชื่อมกันด้วยพันธะไดซัลไฟล์ (disulphide bonds) 4 พันธะ
การทำงานของไลโซไซม์

หน้าที่ และประโยชน์ไลโซไซม์
ไลโซไซม์เป็นเอ็นไซม์ชนิดหนึ่งที่สามารถทำลายผนังเซลล์ของแบคทีเรียได้ ด้วยการกระตุ้นให้เกิดปฏิกิริยาไฮโดรไลสีส (hydrolysis) ที่พันธะเบตา 1-4 ระหว่างกรดเอ็น-อะซิติลมูรามิก (N-actylmuramic acid, NAM) กับเอ็น-อะซิติลกลูโคซามีน (N-acetyinglucosamine,NAG) ซึ่งอยู่ในชั้นเปปทิโดไกลแคน (peptidoglycan layer) ที่เป็นส่วนประกอบของผนังเซลล์แบคทีเรีย ทำให้ผนังเซลล์เกิดรอยแยก (clevage) ส่งผลให้เพิ่มการซึมผ่าน (permeability) บริเวณเยื่อหุ้มเซลล์ ทำให้มีการเปลี่ยนแปลงอิเล็กโทรไลท์ (electrolyte) และระดับความดันออสโมติก (osmotic change) ภายในเซลล์ นอกจากนี้ ยังมีรายงานว่า ไลโซไซม์สามารถเปลี่ยนแปลงเมแทบอลิซึมของกลูโคส ยับยั้งการสร้างกรดของเชื้อกลุ่มสเตร็ปโตคอคไค กระตุ้นให้แบคทีเรียเกิดการเกาะกลุ่ม (aggregation) ทำให้เกิดการชะล้างออกไปจากช่องปาก และยับยั้งการยึดเกาะ (adherenec) ของเชื้อสเตร็ปโตค็อคคัสมิวแทนส์กับผิวฟันได้

ถึงแม้ว่าไลโซไซม์จะเกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันแบบไม่จำเพาะ (non – specific immunity) แต่ไลโซไซม์มีคุณสมบัติทำลายเชื้อแบคทีเรียแบบคัดสรร (selective antibacterial properties) ในปี ค.ศ. 1980 lacono และคณะ รายงานว่าไลโซไซม์ทำลาบเชื้อแบคทีเรียสเตร็ปโตค็อคคัสมิวแทนส์ กลุ่มเอ(serotype a) และกลุ่มบี (serotype b) ได้ดีที่สุด เชื้อสเตร็ปโตค็อคคัสมิวแทนส์กลุ่มซี (serotype c) และกลุ่มดี (serotype d) ตอบสนองได้ดี รองลงมาในขณะที่กลุ่มอี (serotype e) และกลุ่มเอฟ (serotype f) ไม่ตอบสนองต่อไลโซไซม์ ต่อมาในปี ค.ศ. 1982 Wilkensและคณะ ได้ศึกษาผลของไลโซไซม์ร่วมกับเอนไซม์โปรทีเอส พบว่า เอนไซม์โปรทีเอสสามารเพิ่มฤทธิ์ในการทำลายเชื้อสเตร็ปโตค็อคคัสกลุ่มซีได้

มีการศึกษาที่พบว่า ไลโซไซม์สามารถฆ่าเชื้อจุลชีพได้ โดยไม่ต้องอาศัยคุณสมบัติการทำลายผนังเซลล์แบคทีเรีย มีรายงานแม้จะได้รับความร้อน จนทำให้สูญเสียคุณสมบัติการเป็นเอนไซม์ไปแล้ว ไลโซไซม์ก็ยังมีฤทธิ์ในการฆ่าเชื้อจุลชีพได้ เนื่องจากคุณสมบัติการมีประจุบวก (cationic) ของไลโซไซม์ ทำให้เกิดรอยรั่วขึ้นที่เยื่อหุ้มเซลล์ได้ (perturbation of cell membrane)

การศึกษาโครงสร้างของไลโซไซม์ ทำให้ทราบถึงส่วนของไลโซไซม์ที่มีคุณสมบัติในการฆ่าเชื้อจุลชีพ (bactericidal domain) พบว่า เมื่อใช้คลอสทริเพน (clostripain) ซึ่งเป็นเอนไซม์โปรทีเอสชนิดหนึ่งย่อยสลายไลโซไซม์จะทำให้ได้ชิ้นส่วนของโปรตีน (เปปไทด์) ที่มีคุณสมบัติที่ดีขึ้นในการต้านจุลชีพ ทั้งแบคทีเรียแกรมบวก แบคทีเรียแกรมลบ และเชื้อรา ชิ้นส่วนใดของไลโซไซม์ในตำแหน่งกรดอะมิโนที่ 87 – 115 ของไลโซไซม์มนุษย์ฆ่าเชื้อแบคทีเรียแกรมบวก แบคทีเรียแกรมลบ และเชื้อรา โดยชิ้นส่วนของไลโซไซม์ในตำแหน่งกรดอะมิโนที่ 87 – 115 ของไลโซไซม์มนุษย์มีลักษณะรูปร่างเป็นเกลียว-ห่วง-เกลียว (helix-loop-helix motif, HLH) ซึ่งเป็นโครงสร้างที่พบได้ทั่วไปในเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ฆ่าเชื้อแบคทีเรียด้วยการทำให้เกิดรอยรั่วขึ้นที่เยื่อหุ้มเซลล์ มีผู้อธิบายกลไกการทำงานของเปปไทด์ชนิดนี้ไว้ 2 รูปแบบ คือ
1. รูปแบบบาร์เรล-สเตฟว์
รูปแบบนี้ เรียกอีกชื่อหนึ่งว่ารูปแบบเฮลิเคิล-บันเดิล (helicle bundle model) มีกลไกการทำงานโดยเปปไทด์ทำให้เกิดรู (pores) ด้วยการแทรกตัวเข้าไปในชั้นของเยื่อหุ้มเซลล์ในลักษณะขนานกับชั้นฟอสโฟลิปิดสองชั้น (phospholipids bilayer) โดยเรียงตัวให้ด้านที่ไม่ชอบน้ำของเปปไทด์อยู่ชิดกับส่วนที่ไม่ชอบน้ำของฟอสโฟลิปิดของเยื่อหุ้มเซลล์ และส่วนที่ชอบของน้ำเปปไทด์จะอยู่ชิดกับรูที่อยู่ตรงกลางซึ่งมีน้ำอยู่ไอออน และสารโมเลกุลเล็กต่างๆ จึงสามารถผ่านออกไปนอกเซลล์ได้

2. รูปแบบคาร์เป็ท
รูปแบบนี้ เปปไทด์จะปกคลุมเยื่อหุ้มเซลล์ในลักษณะขนานกับเยื่อหุ้มเซลล์ คล้ายลักษณะของการปูพรม โดยหันส่วนที่ไม่ชอบน้ำเข้าติดกับเยื่อหุ้มเซลล์ และหันส่วนที่ชอบน้ำออกสู่ของเหลวที่อยู่ภายนอกเซลล์ จนกระทั่งมีความเข้มข้นของเปปไทด์สูงพอ เยื่อหุ้เซลล์จะเกิดการยุบตัว (collapse) เกิดเป็นรูชั่วคราว (transient) เปปไทด์จึงสามารถแทรกตัวเข้ามาจับกับส่วนที่ไม่ชอบน้ำของฟอสโฟลิปิดสองชั้น (phospholipid bilayer) เยื่อหุ้มเซลล์เกิดรอยรั่ว ส่วนประกอบต่าง ๆ ที่สำคัญภายในเซลล์จึงหลุดออกมานอกเซลล์ได้

เชื่อจุลชีพที่มีรายงานการศึกษาประสิทธิภาพการต้านเชื้อจุลชีพของไลโซไซม์มนุษย์ และชิ้นส่วนของไลโซไซม์มนุษย์ในปัจจุบัน ได้แก่
– บอร์เดเทลลาบรอนไคเซปติกา (Bordetellabronchiseptica)
– เอสเชอริเชียโคไล (Escherichia coli)
– สูโดโมแนส แอรูจิโนสา (Pseudomonas aeruginosa)
– เซอราเทียมาร์เซสเซนต์ (Serratiamarcescens)
– ซัลโมเนลลาไทฟิมิวเรียม (Salmonella typhimurium)
– แบซิลลัสสับทิลิส (Bacillus subtilis)
– ไมโครคอคคัสลูเทียส (Micrococcus luteus)
– สแตปไฟโลค็อคคัส ออเรียส (Staphylococcus aureas)
– สแตปไฟโลค็อคคัสเอพิเดอร์มิดิส (Staphylococcus epidermidis)
– สแตปไฟโลค็อคคัสเลนตัส (Staphylococcus lentus)
– สแตปไฟโลค็อคคัสซูเอพิเดอร์มิคัส (Staphylococcus zooepidermicus)
– แคนดิดา อัลบิแคนส์ (Candidaalbicans)

Ibrahim และคณะ รายงานว่าชิ้นส่วนของไลโซไซม์มนุษย์ตำแหน่งกรดอะมิโนลำดับที่ 87 – 115 สามารถกระตุ้นจุลชีพทุกตัวที่ทดสอบได้ดีกว่าไลโซไซม์มนุษย์ ยกเว้น เอสเชอริเชีย โคไล และเซอราเทียมาร์เซสเซนส์ เท่านั้นที่ไลโซไซม์มนุษย์สามารถทำลายได้ดีกว่า อย่างไรก็ตามจะเห็นได้ว่า ยังไม่มีรายงานการศึกษาเปรียบเทียบประสิทธิภาพของไลโซไซม์ และชิ้นส่วนของไลโซไซม์ในการทำลายเชื้อสเตร็ปโตค็อคคัสมิวแทนส์ ซึ่งเป็นเชื่อก่อโรคฟันผุที่สำคัญ

ในปัจจุบันการศึกษาถึงเปปไทด์ด้านจุลชีพกำลังเป็นที่สนใจอย่างมาก เนื่องจากมีความเป็นไปได้ที่จะนำไปพัฒนาเพื่อใช้ในการรักษาได้ เปปไทด์ต้านจุลชีพมีข้อดี คือ สามารถต้านเชื้อจุลชีพได้อย่างกว้างขวางแบคทีเรียดื้อยาได้น้อย นอกจากนี้ มีรายงานว่า เปปไทด์ของไลโซไซม์ไม่ทำอันตรายต่อเซลล์ร่างกายมนุษย์

วิธีการตรวจวัดไลโซไซม์
1. วิธีการทางอิมมูโนวิทยา
เป็นการตรวจปริมาณไลโซไซม์ในสารตัวอย่าง โดยการนำเอาสารบางชนิด เช่น เอนไซม์ หรือสารกัมมันตรังสี (radioisotope) มาดิดฉลาก (label) เข้ากับแอนติบอดีของไลโซไซม์เพื่อให้เป็นตัวบ่งชี้ว่ามีปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีเกิดขึ้น เทคนิคนี้มีความไว (sensitive) สูง สามารถตรวจสอบสารที่มีปริมาณน้อย ๆ ได้ อย่างไรก็ตามข้อด้อยของวิธีการนี้คือ ค่าใช้จ่ายสูง

2. วิธีการวัดจากแอกทิวิตีของไลโซไซม์ในการทำลายเชื้อแบคทีเรีย
เป็นการตรวจวัดไลโซไซม์โดยดูจากความสามารถในการทำลายเชื้อไมโครค็อคคัสลูเทียส (Micrococcus luteus) ซึ่งเป็นเชื้อที่มีความไวต่อไลโซไซม์ เทคนิคนี้มีข้อดี คือ ทำง่าย ทำซ้ำได้ และค่าใช้จ่ายไม่สูง จึงเป็นเทคนิคที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลาย และสามารถทำได้สองวิธี
1) วิธีไลโซเพลท (Lysoplate assay)
ตรวจไลโซไซม์โดยใส่สารตัวอย่างลงในอะการ์เลี้ยงเชื้อไมโครค็อคคัสลูเทียส นำไปบ่ม (incubation) และวัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของวงใส (clear zone) ซึ่งเป็นผลจากเอนไซม์ย่อยผนังเซลล์แบคทีเรียแล้วประเมินค่าโดยเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานที่ได้จากไลโซไซม์ของไข่ขาวไก่ (hen egg white lysozyme) หรือไลโซไซม์ของมนุษย์ (human lysozyme) ก็จะทราบปริมาณของไลโซไซม์ในสารที่ต้องการตรวจได้

2) วิธีเทอร์บิดิเมทริค (Turbidimetric assay)
เป็นการวัดการดูดกลืนแสง (optical density) ของสารละลายที่เป็นส่วนผสมของเชื้อไมโครค็อคคัสลูเทีนส กับสารตัวอย่างที่ต้องการตรวจ ด้วยเครื่องวัดการดูดกลืนแสง (spectrophotometer) ที่ความยาวคลื่นแสง 490 นาโนเมตร แล้วนำค่าที่ได้นำไปเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานที่ได้จากไลโซไซม์ของไข่ขาวไก่หรือไลโซไซม์ของมนุษย์ ก็จะทราบปริมาณของไลโซไซม์ในสารที่ต้องการตรวจได้

3. วิธีอเล็กโทร-อิมมูโนดิฟฟิวชั่น (electro-immunodiffusion)
เป็นวิธีการวัดปริมาณโปรตีนที่ต้องการตรวจสอบโดยใช้กระแสไฟฟ้าร่วมกับการทำปฏิกิริยากันระหว่างไลโซไซม์และสับสเตรทของไลโซไซม์ คือ เชื้อไมโครค็อคคัสลูเทียส หลักการคือนำตัวอย่างโปรตีนที่มีแอนติเจนที่ต้องการตรวจ หยดลงในหลุมบนเจลอะกาโรสที่มีแอนติบอดีต่อแอนติเจนที่ต้องการตรวจ จากนั้นปล่อยแอนติเจนให้เคลื่อนที่บนสนามไฟฟ้า แอนติเจนจะเคลื่อนตัวบนเจลอะกาโรสไปยังขั้วบวกของสนามไฟฟ้าเกิดการจับกันระหว่างแอนติเจนในสารที่ต้องการตรวจกับแอนติบอดีในเจลอะกาโรส แอนติเจนและแอนติบอดีที่จับกันนี้ละลายน้ำได้ ทำให้เจลอะกาโรสมีลักษณะใส ยิ่งแอนติเจนมีปริมาณมากก็จะยิ่งเคลื่อนที่ในเจลอะกาโรสได้เป็นระยะทางมาก นำค่าระยะทางที่แอนติเจนเคลื่อนที่ไปทำปฏิกิริยากับแอนติบอดี เปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานที่สร้างจากแอนติเจนซึ่งทราบปริมาณแน่นอน ก็จะทำให้ทราบปริมาณแอนติเจนที่ต้องการตรวจได้

advertisement